小麥粉及其制品中氨基脲的測(cè)定

BJS 201902

1 范圍

本方法規(guī)定了小麥粉及其制品中氨基脲殘留的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法。

   本方法適用于小麥粉及以小麥粉為主要原料的各種制品中氨基脲殘留量的檢測(cè)。

2 原理

試樣經(jīng)鹽酸水解，鄰硝基本甲全過(guò)夜衍生，乙酸乙酯提取，旋蒸富集后，采用液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行定性檢測(cè)，采用穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量測(cè)定。

3 試劑和材料

注：水為GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水。

3.1試劑

3.1.1 甲醇（CH₄O）：色譜純。

3.1.2 乙腈（C₂H₃N）：色譜純。

3.1.3乙酸乙酯（C₄H₈O₂）：色譜純。

3.1.4乙酸銨（C₂H₇ NO₂）：色譜純。

3.1.5 正己烷（C₆H₁₄）：色譜純。

3.1.6 鹽酸（HCl）：分析純。

3.1.7 鄰硝基本甲醛（C₇H₅NO₃）：色譜純。

3.1.8 0.2 moL/L鹽酸溶液：準(zhǔn)確量取鹽酸（3.1.6）17 mL于1 L容量瓶中，用水定容至1 L。

3.1.9 0.1 moL/L鄰硝基本甲全溶液：稱(chēng)取1.5 g鄰硝基本甲全（3.1.7）于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至100 mL

3.1.10乙腈飽和的正己烷：量取正己烷（3.1.5）80 mL于100 mL分液漏斗中，加入適量乙腈（3.1.2）后，劇烈振搖，待分配平衡后，棄去乙腈即可。

3.1.11 0.010 moL/L乙酸銨：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.772 g乙酸銨（3.1.4）于1 L容量瓶中，用水定容至1 L。

3.1.12 10%甲醇水溶液：準(zhǔn)確量取10 mL甲醇（3.1.1）于1 L容量瓶中，用水定容至100 mL。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)品

氨基脲及其同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品的基本信息見(jiàn)表1，純度≥99.0%。

表1 氨基脲及其同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品的基本信息

3.3標(biāo)準(zhǔn)溶液配置

3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱(chēng)取14.9 mg（到0.0001g）氨基脲鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品，置于50 mL棕色容量瓶中，用甲醇（3.1.1）溶解并定容至刻度，配成濃度為200 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18℃保存，存效期三個(gè)月。

3.3.2 內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱(chēng)取14.7 mg（到0.0001g）氨基脲-¹³C,¹⁵N₂ 鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品，置于50 mL棕色容量瓶中，用甲醇（3.1.1）溶解并定容至刻度，配成濃度為200 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18℃保存，存效期三個(gè)月。

3.3.3 標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確量取0.2 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（3.3.1），置于200 mL棕色容量瓶中，用甲醇（3.1.1）溶解并定容至刻度，配成濃度為0.200 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，-18℃保存，存效期一個(gè)月。

3.3.4 內(nèi)標(biāo)工作液：準(zhǔn)確量取0.2 mL內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（3.3.2），置于200 mL棕色容量瓶中，用甲醇（3.1.1）溶解并定容至刻度，配成濃度為0.200 mg/L的內(nèi)標(biāo)工作液，-18℃保存，存效期一個(gè)月。

4 儀器與設(shè)備

4.1 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子源。

4.2 天平：感量分別為0.0001 g和0.01 g。

4.3 超聲波發(fā)生器。

4.4 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

4.5 離心機(jī)。

4.5 恒溫箱。

4.6 渦旋混合器。

4.7 高速離心機(jī)。

5 分析步驟

5.1試樣制備

從原始樣品中取出有代表性樣品約500 g，充分混勻，均分成兩份，分別裝入干凈密封袋作為試樣，密封，并注明標(biāo)記。將試樣置于室內(nèi)避光保存。

5.1.1 衍生化

稱(chēng)取約2.0 g（至0.01 g）樣品，置于50 mL玻璃比色管中，加入10 mL 0.2 moL/L鹽酸（3.1.8），渦旋30s后，在依次加入內(nèi)標(biāo)工作液（3.3.4）50 μL，0.1 moL/L鄰硝基本甲全溶液（3.1.9）200 μL，超聲提取10 min，置37℃恒溫箱中過(guò)夜（16h）反應(yīng)。

5.1.2提取

衍生后加入乙酸乙酯（3.1.3）50 mL，具塞后劇烈震搖1 min，超聲提取10 min，用10 mL移液槍吸取上清液40 mL至100 mL蒸發(fā)瓶中，并將其接至旋轉(zhuǎn)器上，于45℃水浴中減壓蒸餾至干，加入2 mL10%甲醇水溶液（3.1.12）充分溶解，含油脂的樣品用4 mL乙腈飽和的正己烷（3.1.10）液液分配，除去脂肪，10000 r/min離心5 min，過(guò)0.20 μm有機(jī)濾膜后，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

5.1.3 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

分別稱(chēng)取5份，每份約2.0 g（至0.01 g）陰性樣品，分別置于50 mL玻璃比色管中，均加入10 mL 0.2 moL/L鹽酸（3.1.8），渦旋30 s后，分別加入標(biāo)準(zhǔn)工作液（3.3.3）10 μL、20 μL、50 μL、100 μL、200 μL，添加濃度分別為1 μg/kg、2 μg/kg、5 μg/kg、10 μg/kg、20μg/kg，再加入內(nèi)標(biāo)工作液（3.3.4）50 μL（即內(nèi)標(biāo)含量為5 μg/kg），余下操作同5.1.1和5.1.2。當(dāng)樣品濃度超出線(xiàn)性范圍時(shí)，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度可根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)整。

5.2 儀器參考條件

5.2.1液相色譜條件

a）色譜柱：MGⅢ-C₁₈柱，150 mm×2.1 mm（i.d.），5.0 μm，或性能相當(dāng)者；

b）柱溫：25℃；

c）進(jìn)樣量：10 μL；

d）流動(dòng)相及洗脫條件見(jiàn)表2。

表2 流動(dòng)相及線(xiàn)性梯度洗脫條件

e）流動(dòng)相流速：0.3 mL/min。

5.2.2 質(zhì)譜條件

a）離子源：電噴霧離子源（ESI）；

b）掃描方式：正離子模式；

c）檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；

d）干燥氣溫度：340℃；

e）干燥氣流速：8 L/min；

f）霧化器壓力；40 psi；

g）毛細(xì)管電壓：4 000 V；

i）定性離子對(duì)、定量離子對(duì)及碰撞能量見(jiàn)表3。

表3 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）條件

注：*為定性離子

5.3 定性測(cè)定

被測(cè)目標(biāo)化合物選擇一個(gè)母離子，2個(gè)以上子離子，在相同實(shí)驗(yàn)條件下，樣品中待測(cè)物質(zhì)的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)溶液中對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間偏差在±2.5%之內(nèi)；且樣品中被測(cè)組分定性離子的相對(duì)豐度與濃度接近的標(biāo)準(zhǔn)溶液中對(duì)應(yīng)的定性離子的相對(duì)豐度進(jìn)行比較，偏差不超過(guò)表4規(guī)定的范圍，則可判定為樣品中存在對(duì)應(yīng)的待測(cè)目標(biāo)化合物。基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜色譜圖見(jiàn)附錄A的圖A.1。

表4定性確證時(shí)相對(duì)離子豐度的大允許偏差

5.4 定量測(cè)定

5.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作

按濃度由小到大的順序，將基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液（5.1.3）分別注入液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜儀中，按儀器參考條件（5.2）進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定氨基脲及其內(nèi)標(biāo)峰面積，以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液中目標(biāo)化合物的濃度和內(nèi)標(biāo)的濃度的比值為橫坐標(biāo)，以目標(biāo)化合物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

5.4.2 試樣溶液的測(cè)定

將試樣溶液（5.1.2）注入液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜儀中，按儀器參考條件（5.2）進(jìn)行測(cè)定，得到相應(yīng)的樣品溶液和內(nèi)標(biāo)物的色譜峰面積比值。利用根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得到試樣測(cè)定溶液中待測(cè)組分的濃度，平行測(cè)定次數(shù)不少于兩次。

5.5空白試驗(yàn)

   除不稱(chēng)取試樣外，均按照以上步驟進(jìn)行。

6 結(jié)果計(jì)算

   試樣中氨基脲含量按式（1）計(jì)算：

X=ρ ……………………………………（1）

    式中：

    X —試樣中氨基脲的含量，單位為微克每千克（μg/kg）；

    ρ —由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得到的試樣中氨基脲的濃度，單位為微克每千克（μg/kg）；

 注：計(jì)算結(jié)果需將空白值扣除,測(cè)定結(jié)果用平行測(cè)定的算術(shù)平均值表示，保留三位有效數(shù)字。

7 精密度

在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的15%。

8 其他

本方法對(duì)小麥粉及其制品中氨基脲殘留的檢出限為0.5 μg/kg，定量限為1.0 μg/kg。

本方法在加標(biāo)量為1.0 μg/kg～10.0 μg/kg內(nèi)，加標(biāo)回收率為75.0%～105.3%。

空白試驗(yàn)，應(yīng)無(wú)干擾。

附錄A

氨基脲特征離子質(zhì)量色譜圖

圖A.1 氨基脲及其同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM 色譜圖

• 氨基脲；2. 氨基脲同位素內(nèi)標(biāo)

本方法負(fù)責(zé)起草單位：北京市食品安全監(jiān)控和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心（北京市食品檢驗(yàn)所）。

驗(yàn)證單位：山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院、河北省食品檢驗(yàn)研究院、國(guó)家食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（上海）、北京市理化測(cè)試分析中心、北京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院。

主要起草人：耿健強(qiáng)、王浩、賈婧怡、陳江龍、張杉、趙文霞。